Фидеслаб - Аллергодиагностика

Диагностика аллергии

 Аллергия    Анализы на аллергию  Анализ на аллергены  Прайс-лист   О лаборатории  На главную
------------------- -------------------
Диагностика аллергии >>> О лаборатории, контакты >>> Общая информация >>> Методы аллергодиагностики для специалистов

Краткий обзор современных методик определения аллерген-специфического IgE в тестах in vitro

Институт аллергологии и клинической иммунологии,
Москва В.С. Малышев, Ю.В. Сергеев, А.В. Караулов

Первым массовым лабораторно-диагностическим методом определения аллерген-специфического IgE (АС-IgE) in vitro был радиоаллергосорбентный тест (RAST), основанный на измерении связывания меченых радиоактивной меткой анти-IgE-антител с АС-IgE, после инкубации исследуемой сыворотки крови с аллергенами, фиксированными на твердом носителе. В качестве подобного носителя наибольшее распространение получили целлюлозные диски (аллергодиски). В настоящее время, основоположник RAST-тестов, фирма “Phadia” (Pharmacia Diagnostics. Швеция), дает пользователям возможность выбора методики проведения анализа либо в формате RAST, либо в формате иммунофлюоресцентного анализа (метод ImmunoCAP). Спектр выпускаемых фирмой аллергодисков насчитывает несколько сотен и включает целый ряд уникальных и редких аллергенов. В 1995 году фирма разработала комплекс приборов UniCAP (ImmunoCAP), позволивший автоматизировать проведение лабораторного анализа и сократить время выполнения анализа до 2,5 часов.

Среди методов выявления АС-IgE с использованием аллергодисков наиболее частыми являются методики, основанные на твердофазном иммуноферментном анализе, позволяющие использовать в работе стандартное оборудование. При этом аллергодиски после инкубации с тестируемой сывороткой обрабатывают конъюгатом анти-IgE-антител с ферментом, а затем вносят хромогенный субстрат. Учет результатов проводится обычно с помощью серийных микропланшетных анализаторов. Использование прилагаемых стандартных сывороток с известным содержанием АС-IgE позволяет рассчитывать калибровочные кривые для оценки концентрации АС-IgE в сыворотке. Время выполнения анализа варьирует у разных производителей в зависимости от условий проведения: 3 часа при 370С на термошейкере (Hycor Biomedical), 5 часов при 370С (Allergopharma) или при комнатной температуре (Cypress Diagnostics), 20-24 часа при комнатной температуре (Allergopharma, Hycor Biomedical).

По пути предоставления пользователю возможности выбора технологии постановки теста пошла фирма “Dr. Fooke”. Проведение анализа возможно как в микропробирках (скрининг), так и в микропланшетах (количественное определение). Время выполнения анализа в первом случае составляет около 20 часов, а во втором – около 5 часов. При проведении анализа в микропробирках необходим лишь фотометр с фильтром 405 нм, что делает данный метод доступным практически для всех лабораторий. Спектр выпускаемых нитроцеллюлозных аллергодисков позволяет тестировать АС-IgE к более чем 700 аллергенами. Выпускаемая фирмой оригинальная «Турбо-микро-система» позволяет сократить время анализа до 2,5 часов при уменьшении объема пробы на один аллергодиск до 5 мкл. Для больших объемов исследований выпускается автоматический микропланшетный анализатор. Дополнительно фирмой выпускаются реактивы, предоставляющие возможность определения аллергенспецифичных IgG и IgG4 –антител.

Важным преимуществом всех вышеперечисленных тест-систем является возможность выбора произвольной комбинации тестируемых аллергенов, что становится особенно значимым ввиду высокой стоимости аллергодисков. Эффективное снижение себестоимости тестирования возможно при использовании аллергодисков с нанесенной смесью из 3-5 и более родственных аллергенов в предварительном скрининговом анализе. Спектр выпускаемых аллергодисков с смесями аллергенов, составляющий обычно несколько десятков наименований, включает все наиболее распространенные аллергены.

Одновременно, широкое распространение в последние 10-12 лет получили различные тест-системы с «батарейным» способом тестирования АС-IgE, в которых определение проводится сразу с серией аллергенов, сгруппированных обычно по признаку общности пути поступления в организм (пищевые, пыльцевые и т.п.). Примером подобных тест-систем является MAST CLA (фирмы Hitachi), в котором серия целлюлозных носителей аллергенов фиксирована в камере, которая заполняется тестируемой сывороткой крови. Выполнение реакции занимает 2 рабочих дня. Детекция АС-IgE основана на их хемилюминесцентном окрашивании в ходе тестирования, которое оценивается с помощью специального люминометра. В результате измерения проводится полуколичественное определение уровней АС-IgE, что позволяет выдавать в ответе класс уровня каждого АС-IgE в сыворотке. Фирма выпускает несколько типов «панелей» аллергенов, включающих 16 или 36 аллергенов каждая. Наиболее широко известны в РФ пищевая и смешанная (так называемая «Российская») панели.

Примером упрощенного экспресс-анализа АС-IgE с панелью аллергенов служит тест-система IVT ALLERGY. В этом случае связывание АС-IgE происходит в капиллярной трубке внутри которой иммобилизированы аллергены. Сыворотка всасывается в трубку с помощью шприца на 1,5 часа, затем удаляется и замещается коньюгатом анти-IgE-антител с уреазой еще на 1,5 часа. На последнем этапе, после отмывки, трубку заполняют субстрат/индикатором и проводят визуальную оценку окрашивания в реактивных сегментах. Выпускаются два типа тестов: со «стандартной» или с «детской» панелями аллергенов. В первом случае в трубке нанесено 11 различных смесей ингаляционных аллергенов (включая пыльцевые, плесневые и клещевые), а во втором - как ингаляционные, так и ряд пищевых аллергенов (из молока, яиц, пшеницы и рыбы). Проведение данного теста практически не требует дополнительного оборудования, однако его результаты следует подтверждать более чувствительными методами.

Другим примером методики одновременного тестирования АС-IgE к серии аллергенов являлся тест производства “CMG-Heska” (в РФ выпускался фирмой «ДИАплюс»). На нитроцеллюлозных индикаторных полосках раздельно сорбировано по 5 аллергенов из определенной группы (бытовые, пищевые, пыльцевые или грибковые), наличие АС-IgE к которым тестируется в классическом двухстадийном иммуноферментном анализе. Общее время анализа 3,5 часа. Из дополнительного оборудования необходим только шейкер. Учет результатов проводят визуально с условным делением интенсивности связывания АС-IgE по 4-м классам с помощью цветовой шкалы. В аналогичном тесте возможен скрининговый анализ АС-IgE к смешанным аллергенам сразу из всех групп.

На основе метода иммуноблота (Western-blotting), основанного на разделении белковых смесей на основе молекулярной массы, возможно проведение подробного анализа АС-IgE к различным компонентам сложных аллергенов. В большинстве случаев подобные тесты используются в научно-исследовательских целях при изучении аллергенных свойств белков, однако фирмой DPC (Diagnostic Products Corporation) выпускаются коммерческие иммуноблоты AlaBLOT к аллергенам из D. pteronissinus, D. farinae, латексу, яду насекомых и другим. Применение AlaBLOT позволяет проводить анализ как АС-IgE, так и аллергенспецифических иммуноглобулинов других классов ко всем компонентам сложных аллергенов. Данный метод наиболее информативен при динамическом наблюдении за пациентами, получающими СИТ.

Дальнейшее развитие использования модификации метода иммуноблота для количественного анализа АС-IgE получило в тест-системе AllergoScan фирмы Innogenetics. На индикаторных полосках раздельно нанесены по 20 наиболее часто встречающихся аллергенов (выпускаются «ингаляционная» и «пищевая» панели), а также серия из 4 внутренних контролей. Высокая чувствительность теста достигнута путем применения трехстадийной схемы анализа: за этапом связывания АС-IgE с сорбированными аллергенами следует этап инкубации с биотинилированными анти-IgE-антителами, который сменяется этапом обработки полосок коньюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой. Общее время анализа составляет 3 часа. Оценка и учет результатов производятся путем автоматического сканирования на обычном планшетном сканере. Одновременно возможно сканирование до 16 иммуноблотов AllergoScan. С помощью оригинальной программы QuantiScan проводится обработка данных для каждой полоски на основе ее внутренних контролей, что позволяет избежать постановку отдельных контрольных исследований для построения калибровочной шкалы. Результат анализа выдается в виде бланка, содержащего:

  • значения абсолютных концентраций АС-IgE для тестированных аллергенов,
  • их принадлежность к одному из 6 условных классов уровней АС-IgE,
  • уровни АС-IgE, представленные в графической форме.

Эта же программа сохраняет все полученные результаты в базах данных, что существенно облегчает документирование анализов. Тест AllergoScan является примером удачного сочетания высокой чувствительности метода при минимальных затратах на оборудование. Аналогичные тесты выпускаются и другими зарубежными производителями, например RIDA AllergyScreen (R-Biopharm) или Polychek (Biochek). В случае RIDA теста требуется приобретение специального сканера с программным обеспечением.
Разработка новых методов аллергодиагностики тесно связана с технологическим прогрессом в лабораторной диагностике в целом. Основными направлениями дальнейшего развития аналитических методов являются повышение чувствительности, миниатюризация, автоматизация и сокращение времени проведения анализа. Ниже кратко рассмотрены лишь два из серии перспективных новых подходов к тестированию АС-IgE in vitro.

Примером необычной трансформации широко применяемого метода проточной цитометрии в перспективный метод иммунохимического анализа является технология LabMAP фирмы Luminex, основанная на флюоресцентном анализе полистероловых микрочастиц, несущих различные антитела, антигены, олигонуклеотидные пробы и т.п. . Возможность анализа определяется наличием до 100 различных типов данных микрочастиц, отличающихся соотношением двух флюорофоров, входящих в их состав. При проточной флюороцитометрии возможен анализ по отдельным типам микрочастиц. С использованием предварительной раздельной сорбции на микрочастицах определенных антигенов (аллергенов) появляется возможность одновременного связывания в одной пробирке широкого спектра антител. В предварительных исследованиях по аллергодиагностике была проведена сорбция 64 аллергенов на разных типах микрочастиц с их последующим смешиванием. После инкубации с тестируемой сывороткой микрочастицы отмывали и инкубировали с анти- IgE антителами, коньюгированными с флюоресцеином. При цитометрическом анализе на основе учета двойной флюоресценции был проведен анализ наличия АС-IgE к использованным аллергенам, подтвердивший высокую чувствительность метода. Уникальностью метода является возможность составления в одной пробирке любых комбинаций исследуемых аллергенов, сорбированных на микрочастицах.

Представленный краткий обзор современных лабораторных методов диагностики АС-IgE был бы неполным без упоминания о новой технологии «микрочипов», которую многие считают технологией будущего. Не касаясь технических сторон необходимо отметить, что главной особенностью данной технологии проведения лабораторных анализов является микроминиатюризация тест-систем на основе последних достижений науки. При этом на поверхности определенных носителей (силикон, стекло, пластмасса) формируют структурные объемы (камеры, каналы и др.), в которые встраивают элементы диагностической системы (электроды, фильтры, диафрагмы и т.п.). Общая рабочая поверхность таких «микрочипов» составляет обычно 1-2 см2 при толщине несколько миллиметров. Хотя производство диагностических «микрочипов» началось лишь несколько лет назад, ряд ведущих фирм уже выпускают их для многих видов анализов. Одна из них, фирма Randox, представляет, среди других тестов, «биочипы» для выявления АС-IgE. Фирма выпускает «биочип» для скрининга по 17 смешанным группам аллергенов (домашняя пыль, пыльца трав и деревьев, домашние животные и др.), а также 2 «биочипа» с ингаляционными аллергенами и 1 – с пищевыми аллергенами. Для анализа на каждый аллерген достаточно всего по 1 мкл сыворотки. Методика тестирования основана на конкурентном иммунофлюоресцентном анализе. Постановка реакции осуществляется в автоматическом приборе Evidence и занимает всего около 1 часа. Несомненно, что в ближайшее время появится информация о «микрочипах» для анализа на АС-IgE и от других фирм-производителей.

В данном обзоре представлена только часть из широкого спектра методик выявления АС-IgE in vitro.


ИАКИ (Институт аллергологии и клинической иммунологи), Москва, д.б.н. В.С. Малышев.


Контакты:

Тел.:8(916) 541-98-70
(499) 201-05-77
E-mail: fideslab@yandex.ru

О лаборатории


Полезная информация

на главную


   Яндекс.Метрика