Фидеслаб - Аллергодиагностика

Диагностика аллергии

 Аллергия    Анализы на аллергию  Анализ на аллергены  Прайс-лист   О лаборатории  На главную
------------------- -------------------
Диагностика аллергии >>> О лаборатории, контакты >>> Основные методики >>> Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов

Оценка фагоцитарного звена системы иммунитета является неотъемлемым элементом оценки иммунного статуса, который нарушается при многих воспалительно-инфекционных заболеваниях. Для оценки фагоцитарного звена системы иммунитета используют исследование количества и функциональной активности нейтрофилов (реже моноцитов) крови.

Определяют:
  1. процент и общее число, морфологию нейтрофилов крови
  2. поглотительную активность нейтрофилов по поглощению частиц латекса, стафилококков, кандид
    • вычисляют фагоцитарное число (среднее число поглощенных частиц)
    • подсчитывают фагоцитарный индекс (процент нейтрофилов участвующих в фагоцитозе)
  3. метаболическую активность нейтрофилов по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) в формазан
  4. хемотаксическую подвижность – по оценке подвижности к хемотаксическому веществу
  5. адгезивную активность – по прилипанию к поверхностям, а также выявляют молекулы адгезии с помощью моноклональных антител
  6. оценивают фенотип нейтрофилов – рецепторы и CD-антигены
  7. определяют переваривающую активность (фагоцитарный киллинг).

Важнейшими среди этих показателей являются поглотительная и переваривающая активность нейтрофилов, так как они прямо отражают их противоинфекционные возможности. При использовании для оценки переваривающей активности нейтрофилов бактерий трудно исследовать эту функцию. Основным методом оценки переваривания бактерий нейтрофилами является разрушение лейкоцитов, посев на питательную среду и подсчёт выросших колоний бактерий. Другой метод – оценка путём проточной цитометрии меченых бактерий или кандид. Хотя последний метод достаточно точен, но требует дорогостоящей аппаратуры, недоступной большинству лабораторий.

R. Lehrer и M. Cline заметили, что живые клетки Candida albicans не окрашиваются метиленовым синим, в то время как мёртвые клетки окрашиваются этим красителем. Это наблюдение позволило решить проблему учёта количественной характеристики киллинга дрожжевых клеток фагоцитами. В последующем J.S. Solomkin с соавторами разработали метод, позволяющий оценивать кинетику фагоцитоза, который не претерпел практически никаких изменений до наших дней, за исключением вариаций объёкта фагоцитоз, когда в качестве объекта используют, например, Saccharomices cerevisiae.

Нами разработан метод оценки активности фагоцитарного звена иммунитета, а именно, поглотительной и переваривающей активности нейтрофилов.

Показания к применению

Все виды иммунопатологии. Первичные и вторичные иммунодефицитные болезни, аллергические и аутоиммунные заболевания.

Иммунологический мониторинг населения, проживающего в экологически неблагоприятных регионах.

Контроль за иммунотерапией заболеваний, состоянием иммунитета после противоопухолевой химио и лучевой терапии.

Разработка и проведение доклинических и клинических испытаний иммуномодуляторов.

Перечень необходимого оборудования:

  1. Центрифуга (1000 об /мин).
  2. Камера Горяева или Солар.
  3. Стеклянные центрифужные пробирки 10 мл (100 шт.).
  4. Термостат.
  5. Автоматические дозаторы 20 – 200 мкл.
  6. Микроскоп с иммерсионным увеличением.
  7. Предметные стёкла (50 шт.)

Реактивы.

  1. Физиологический раствор хлорида натрия на фосфатном буфере (ФСБ) рН 7,2 или раствор Хенкса.
  2. Культура Candida albicans. Метиленовый синий. Азур. Эозин

Описание технологии использования метода

Подготовка Candida albicans

Готовят рабочую взвесь отмытых кандид (5.107 клеток в 1 мл). Оценивают жизнеспособность кандид и используют только суспензию содержащую не менее 96% живых Candida albicans. Для этого смешивают 0,05 мл суспензии кандид и 0,1 мл краски (смесь равных объемов 0,2% раствора водного эозина и 0,1% метиленового синего на дистиллированной воде), через 10 минут взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут на центрифуге ОПН-3, надосадочную жидкость отсасывают, а из осадка делают мазок, высушивают и подсчитывают при световой микроскопии 200 кандид. Оценивают процент живых, имеющих легкое розовое окрашивание и неживых, окрашенных синькой, дрожжевых клеток.

Подготовка суспензии лейкоцитов больного

Утром, натощак, берут 5-10 мл крови из вены в пробирку с гепарином (20 ед. на 1 мл крови). Кровь отстаивают в пробирке в течение 1 часа, до момента четкого отделения эритроцитов от лейкоцитов. Кончик пипетки опускают близко к осевшим эритроцитам и вращательным движением пипетки поднимают осевшие эритроциты, до окрашивания плазмы в легкий красный цвет (смесь эритроцитов с лейкоцитами предотвращает агрегацию лейкоцитов и облегчает подсчет показателей фагоцитоза) и забирают по 0,1 мл такой плазмы на каждую пробу. Количество фагоцитов в методе не стандартизируется, а берется их реальное содержание в плазме через 1 час отстаивания.

Оценка поглотительной активности нейтрофилов

Оценивают фагоцитарный индекс (ФИ), фагоцитарное число (ФЧ) и киллинг в % убитых клеток через 30 и 60 минут инкубации. Все пробы дублируют. В каждую пробирку вносят 0,1 мл плазмы исследуемого пациента и добавляют 0,05 мл рабочей взвеси кандид. Пробы инкубируют в термостате 30 и 60 минут при 37С. Затем взвесь клеток центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин, отсасывают 0,05 мл надосадочной жидкости, осадок аккуратно ресуспензируют и наносят 0,05 мл в виде капли на край предметного стекла. Затем отполированным краем второго предметного стекла размазывают каплю по стеклу, делая тонкий мазок, высушивают, фиксируют спиртом и окрашивают азур-эозином (по Романовскому) в течение 5-10 минут.

Вычисляют фагоцитарный индекс Гамбургера, для этого при световой микроскопии, под иммерсией подсчитывают процент фагоцитов имеющих поглощённые кандиды.

Находят фагоцитарное число Райта (среднее число фагоцитированных кандид на один фагоцит): подсчитывают количество кандид в этих фагоцитах и делят на количество этих фагоцитов. При исследовании этих показателей оценивают 200 нейтрофилов.

Оценка киллинга кандид нейтрофилами

К 0,05 мл взвеси клеток оставшихся в пробирке добавляют 0,2 мл дистиллированной воды для лизиса клеток крови. Затем, добавляют 0,5 мл краски (смесь равных объемов 0,2% раствора водного эозина и 0,1% метиленового синего на дистиллированной воде) для окрашивания убитых фагоцитами кандид на 10 мин. Далее взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут, надосадочную жидкость отсасывают, а из осадка делают мазок, высушивают и подсчитывают при световой микроскопии процент убитых фагоцитами, окрашенных синькой, дрожжевых клеток. Живые кандиды имеют лёгкое розоватое окрашивание. Оценивают 200 кандид.

Результаты

Исследование двух показателей фагоцитарного звена системы иммунитета у 30 здоровых людей (доноров) показало, что после 30 минутной инкубации фагоцитарный индекс составил 74,6+-10,3%; фагоцитарное число - 2,7+-0,35; киллинг - 26,3+-4,1%.

В соответствии с этим в норме показатели фагоцитарного звена системы иммунитета с использованием Candida albicans следующие:

  • фагоцитарный индекс 65-85% (74,6+-10,3%)
  • фагоцитарное число 2,5-3,0 (2,7+-0,35)
  • киллинг 22-30% (26,3+-4,1).

Исследование этих показателей в динамике позволяет оценить скорость лизиса поглощённых клеток. Повышение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа при сохранённом киллинге указывает на дефицит переваривания дрожжевых клеток. Уменьшение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа через 30 минут указывает на дефицит поглощения. Уменьшение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа может наблюдаться через 60 мину при интенсивном лизисе дрожжевых клеток.

Примечателен факт высокой точности предлагаемого нами метода оценки показателей фагоцитарного звена системы иммунитета. При сравнении результатов полученных нашим методом (фагоцитарный индекс нейтрофилов цельной крови после 30 минутной инкубации 74,6+-10,3%) и результатов с использованием проточного цитофлюориметра (фагоцитарный индекс нейтрофилов цельной крови доноров после 30 минутной инкубации 75+-10%) [4] отмечено абсолютное сходство.

Контакты:

Тел.:8(916) 541-98-70
(499) 201-05-77
E-mail: fideslab@yandex.ru

О лаборатории


Полезная информация

на главную


   Яндекс.Метрика