Фидеслаб - Аллергодиагностика

Диагностика аллергии

 Аллергия    Анализы на аллергию  Анализ на аллергены  Прайс-лист   О лаборатории  На главную
------------------- -------------------
Диагностика аллергии >>> О лаборатории, контакты >>> Основные методики >>> Методика определения общего IgE

Интсрукция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения общего иммуноглобулина в сыворотке крови
ИФА-общий IgE

Рекомендована Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического анализа Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол № 8 от 22 сентября 2003 г.)

1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. Набор реагентов ИФА-общий IgE предназначен для количественного определения содержания общего иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Иммуноглобулин Е (IgE) - класс иммуноглобулинов, содержание которого в сыворотке крови в норме крайне мало. Концентрация IgE в сыворотке крови возрастает постепенно с момента рождения человека до подросткового возраста. У взрослых людей концентрация IgE в норме может достигать 100 МЕ/мл. В пожилом возрасте уровень IgE иногда снижается. Продукция IgE имеет существенное значение в антигельминтозном иммунитете. При аскаридозе обнаруживается 15-20-кратное повышение концентрации IgE. Однако в развитых странах выявление повышенных концентраций IgE чаще связано с развитием аллергических заболеваний. Определение общего IgE имеет важное прогностическое значение. Его уровень выше 95 % верхнего возрастного предела нормы выявляют у 75 % детей, родители которых имеют аллергические заболевания. Выявление высоких концентраций общего IgE в сыворотке крови является важным вспомогательным средством, позволяющим дифференцировать аллергические забо-левания среди множества патологий, клинически проявляющихся как астма, частые заболевания дыхательных путей, хронические риниты и дерматиты. Повышенные концентрации IgE в сыворотке крови отмечают также при гипер-IgE синдроме, лимфосаркоме.

1.3. Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ при использовании всех стрипов одновременно (всего 96 определений).

Примечание: в случае дробного применения набор может быть использован только в течение месяца после вскрытия компонентов набора.

2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА

В наборе ИФА-общий IgE использован "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к IgE. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-IgE-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация общего IgE, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-IgE-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации IgE. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству общего IgE в исследуемом образце.

Во время инкубации с ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного конъюгата анти-IgE-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация общего IgE в исследуемых образцах.

3. СОСТАВ НАБОРА

  • Комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к общему IgE, маркирован "Стрипы с моноклональными антителами к общему IgE" - 1 пакет;
  • калибровочные пробы на основе сыворотки крови, аттестованные по Второму международному референсному препарату WHO 75/502 на общий IgE, содержащие известные количества общего IgE: 0; 10; 50; 100; 250; 500 МЕ/мл; концентрации общего IgE в калибровочных пробах могут несколько отличаться от указанных величин, точные величины указаны на этикетках флаконов - 6 флаконов (лиофилизованные препараты или жидкости по 0,5 мл);
  • конъюгат анти-IgE-пероксидаза, маркирован "Конъюгат Е" - 1 флакон (18 мл);
  • концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован "Буфер Р" - 1 флакон (14 мл);
  • буфер для разведения образцов сыворотки крови, маркирован "Буфер Д" - 1 флакон (3,0 мл);
  • раствор тетраметилбензидина, маркирован "Раствор ТМБ" - 1 флакон (14 мл);
  • стоп реагент (1 Н соляная кислота), маркирован "Стоп-реагент" - 1 флакон (14 мл);
  • контрольная сыворотка на основе сыворотки крови человека с известным содержанием общего IgE, маркирована "Контрольная сыворотка" - 1 флакон (лиофилизованный препарат или жидкость 0,5 мл);
  • пакет полиэтиленовый закрывающийся (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена).

4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

4.1. Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции моноклональных антител к IgE с IgG, IgM, IgA.

4.2. Коэффициент вариации результатов определения общего IgE в одном и том же образце сыворотки крови с использованием набора ИФА-общий IgE не превышает 8%.

4.3. Линейность. Зависимость концентрации общего IgE в образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне концентраций 10-500 МЕ/мл и составляет ±10%.

4.4. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на "открытие" общего IgE - соответствие измеренной концентрации общего IgE предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы 50 МЕ/мл. Процент открытия составляет 90-110%.

4.5. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация общего IgE в сыворотке крови человека не превышает 2,3 МЕ/мл.

4.6. В наборе ИФА-общий IgE значения концентраций калибровочных проб выражены в МЕ/мл. Для пересчета концентраций в нг/мл необходимо значение концентрации в МЕ/мл умножить на 2,4.

4.7. Хук-эффект высоких концентраций. В наборах реагентов, основанных на "сэндвич"-принципе анализа, при высоких концентрациях аналита зависимость величины оптической плотности от концентрации становится обратно пропорциональной (так называемый хук-эффект высоких концентраций). При использовании набора ИФА-общий IgE хук-эффект не обнаружен вплоть до концентрации общего IgE 10 000 МЕ/мл.

4.8. Клиническая проверка. Содержание общего IgE измеряли в сыворотке крови, взятой с 9 до 11 часов, у 79 здоровых лиц и 226 больных, страдающих различными аллергическими заболеваниями, в возрасте 21-45 лет. У 48% здоровых лиц концентрация общего IgE была ниже 25 МЕ/мл, у 34% - от 25 до 100 МЕ/мл, у 18% - более 100 МЕ/мл. У 8% больных, страдающих аллергическими заболеваниями, концентрация общего IgE была ниже 25 МЕ/мл, у 22% - от 25 до 100 МЕ/мл, у 70% - более 100 МЕ/мл.

4.9. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения концентраций общего IgE, соответствующие нормальным.

5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

5.1. Потенциальный риск применения набора - класс 2а.

5.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

5.3. При работе с набором следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отде-лах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).

5.4. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. в состав набора входят образцы и производные крови человека, которые являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

5.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

5.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназна-ченных для работы с наборами.

6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ

  • Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм;
  • прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебаний 3-4 мм и частотой 8-13 Гц (500-800 об/мин) при температуре +37°С;
  • пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл; 1000-5000 мкл;
  • пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл;
  • цилиндр мерный, позволяющий отмерять 300 мл;
  • стакан стеклянный вместимостью 500 мл;
  • вода дистиллированная;
  • бумага фильтровальная;
  • перчатки резиновые или пластиковые.

7. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка.

  • Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.
  • Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к крышкам. Открыть флаконы и положить крышки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5 мл дистиллированной воды и закрыть крышками. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18…25°С) без перемешивания. Затем, аккуратно на-клоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая пенообразования. В течение следующих 10 минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая.
    Хранить при температуре +2…8°С не более 1 месяца.

7.2. Буфер Д готов к использованию.

7.3. Предварительное разведение исследуемых образцов сывороток крови. Если значения концентрации общего IgE в исследуемых образцах по предварительным данным выше 500 МЕ/мл, образцы следует развести буфером Д в 20 раз: 190 мкл буфера Д + 10 мкл исследуемого образца.
При каждом разведении необходимо тщательное перемешивание.

7.4. Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необходимо выдержать при комнатной температуре (+18…25°С) в течение времени не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в прозрачный пакет с замком и герметично закрыть. Хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2…8°С в течение всего срока годности.

7.5. Конъюгат анти-IgE-пероксидаза готов к использованию.

7.6. Промывочный буфер. Необходимое количество буфера Р развести дистиллированной водой в 20 раз. Например:
5 мл буфера Р + 95 мл дистиллированной воды.
Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре не более 5 суток. Оставшийся неиспользованным буфер Р хранить закрытым при температуре +2…8°С в течение всего срока годности.

7.7. Раствор тетраметилбензидина (ТМБ) готов к использованию.

7.8. Стоп-реагент готов к использованию.

8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры (+18…25°С). На странице 15 приведена схема проведения анализа.

8.2. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом:
А1, А2 - №1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;
B1, B2 - №2 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 0 МЕ/мл;
C1, C2 - №3 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 10 МЕ/мл;
D1, D2 - №4 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 50 МЕ/мл;
E1, E2 - №5 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 100 МЕ/мл;
F1, F2 - №6 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 250 МЕ/мл;
G1, G2 - №7 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 500 МЕ/мл;
H1, H2 - №8 для измерения величины оптической плотности контрольной сыворотки.

8.3. Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 150 мкл конъюгата анти-IgE-пероксидаза.

8.4. Внести в соответствующие лунки по 20 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 20 мкл исследуемой сыворотки крови в дубликатах.
Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным результатам.

8.5. Инкубировать стрипы в течение 1,5 часов при встряхивании в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500-800 об/мин.

8.6. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.6, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5-10 секунд с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.
Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устройства.

8.7. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной температуре (+18…25°С) в течение 15-30 минут в зависимости от степени развития окраски.

8.8. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1-2 минут.

8.9. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм.
Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В - среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы.
Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В-BТ, где ВТ - среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2.
В линейных координатах построить калибровочный график зависимости В (ед. опт. плотн.) от концентрации общего IgE в калибровочных пробах (МЕ/мл).
Определить содержание общего IgE в пробах по калибровочному графику. В случае дополнительного разведения образцов необходимо измеренную концентрацию IgE умножить на фактор разведения.

8.10. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п. 8.8, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение времени не более 20 минут при комнатной температуре (+18…25°С).

9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

9.1. Набор ИФА-общий IgE должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2…8°С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5 суток.
Срок годности набора - 12 месяцев.
В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом: o стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в прозрачный пластиковый пакет с замком и герметично закрыть. Хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2…8°С в течение всего срока годности;

  • восстановленные (растворенные) из лиофилизованных препаратов калибровочные пробы и контрольную сыворотку хранить при температуре +2…8°С не более 1 месяца;
  • жидкие, готовые к использованию, калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить при температуре +2…8°С не более 1 месяца;
  • конъюгат Е, буфер Д и раствор ТМБ после вскрытия флаконов хранить при температуре +2…8°С не более 1 месяца;
  • буферный раствор для промывки лунок, подготовленный к использованию, хранить закрытым при комнатной температуре (+18…25°С) не более 5 суток;
  • буфер Р и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при температуре +2…8°С в течение всего срока годности.

9.2. Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре +2…8°С не более 2 дней; при необходимости более длительного хранения (до 3 месяцев) - при температуре -20°С и ниже. Избегать повторных циклов замораживания-размораживания.

9.3. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизированную и мутную сыворотку крови, а также сыворотку крови, содержащую азид натрия.

9.4. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика и рекомендуется определение концентрации общего IgE в контрольной сыворотке.

9.5. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

9.6. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.

Контакты:

Тел.:8(916) 541-98-70
(499) 201-05-77
E-mail: fideslab@yandex.ru

О лаборатории


Полезная информация

на главную


   Яндекс.Метрика