Фидеслаб - Аллергодиагностика

Диагностика аллергии

 Аллергия    Анализы на аллергию  Анализ на аллергены  Прайс-лист   О лаборатории  На главную
Аналитический обзор по поллинозу
Ингаляционная аллергия >>> Поллиноз >>> Аналитический обзор по поллинозу >>> Приготовление препаратов аллергенов пыльцы для лечения

Приготовление препаратов аллергенов пыльцы для диагностики и лечения

Самым главным методом изготовления аллергенных экстрактов для лечебных и диагностических целей является экстрагирование необходимых аллергенов из природной матрицы (биообъектов). Приготовление экстрактов аллергенов на основе природного сырья состоит из следующих этапов: измельчения, экстракции, очистки, диализа, стерилизации, пробы на токсичность (рис.6). В процессе измельчения предварительно отобранного сырья происходит разрушение клеточных мембран, что приводит к значительному увеличению общей поверхности сырьевого материала. Для проведения измельчения используют специальную аппаратуру (лабораторный миксер, ультразвуковые приборы и др.). Больше всего проблем технологического характера возникает при пробоподготовке таких материалов, как перо, шерсть животных, шелк и т.п.

Для экстракции используют слабощелочную среду (pH=7,5–8,5), поскольку в процессе экстрагирования зачастую происходит подкисление раствора. Для обеспечения постоянного рН принято использовать следующие буферные растворы:

  • щелочной раствор Кока применяется для приготовления экстрактов из грибов, домашней пыли, пыльцы и др.;
  • буферный раствор с NaCl чаще всего используется для экстрактов из овощей, орехов, фруктов, эпидермиса животных и т. д. [64].

Обезжиренный материал смешивают с наиболее подходящим раствором, затем проводят экстрагирование при комнатной температуре в  ест-системе от 17 до 24 часов при постоянном встряхивании. Согласно технике Frugoni экстракцию проводят 12%-раствором этилового спирта (соотношение материала к  экстрагенту равно 1:9) продолжительностью 48–72 часов в холодильной камере. Процесс очистки сырьевого материала может включать осаждение, центрифугирование, фильтрацию, либо комплекс этих методов. Получение максимального количества высокоочищенного экстракта аллергена, и минимизация потерь при изготовлении, являются основными техническими задачами на данном этапе.

После предварительной очистки следует диализ, в процессе которого происходит удаление низкомолекулярных веществ и пигментов, способных вызвать нежелательные побочные реакции (например, раздражения кожи). Использование данного метода проводят для экстракции аллергенов из некоторых продуктов питания, домашней пыли. Высокомолекулярные примеси можно исключить благодаря применению каскадного способа фильтрации. Однако, в готовом экстракте остается некоторое количество сопутствующих компонентов, которые не проявляют иммунологических свойств (балласт), что является одним из недостатков данного метода.

Как правило, экстракты аллергенов, особенно предназначеные для инъекционного введения, на следующем этапе подвергаются стерилизации. Фильтрация через бактериальные фильтры — наиболее приемлемый способ стерилизации, позволяющий сохранить структуру термолабильных веществ. После стерилизации экстракт переносят в стерильную посуду. Также необходим дополнительный контроль на стерильность и рН, при обязательном проведении микробиологического и токсикологического контролей. Полученный экстракт должен представлять собой высокоочищенный препарат с точным указанием качественного и количественного состава [65].

Получать аллергенные экстракты помимо природных источников возможно с помощью биотехнологического производства. Технологии уже сейчас позволяют получать большое количество важных аллергенов (аллергены пыльцы растений, эпидермиса животных, постельного клеща, ядов насекомых и др.), представляющих собой индивидуальные рекомбинантные белки, которые обладают иммунологической активностью, сопоставимой с аналогичными белковыми аллергенами, встречающимися в природе [66].

Развитие технологии получения рекомбинантных препаратов аллергенов способствовали и развитию отдельной диагностической области - аллерген специфической иммунотерапии (АСИТ). Для лечения аллергии важно понять, является ли пациент сенсибилизирован к одному или нескольким источникам аллергенов, а также нет ли у него кросс-реактивной (перекрестной) реаккции на другие аллергены [67]. Сейчас разработаны специальные диагностические тесты – Component-Resolved Diagnosis, основанные на препаратах аллергенов, полученных методом рекомбинантной экспрессии кДНК, кодирующей аллерген, или путем их глубокой очистки из природных источников [68]. Подобные диагностические тесты включают маркерные аллергены для диагностики сенсибилизации больных к конкретному аллергену или к кросс-реактивным структурам и белкам, указывающим на перекрестную чувствительность к нескольким источникам аллергенов [69].

Появление рекомбинантных антигенов также внесло вклад и в развитие метод микрочипового анализа, внедряемого в диагностическую практику [70, 71]. Белковые микрочипы содержат рекомбининтные аллергены и пыльцевые экстракты многих видов растений (и других аллергенов), и после их инкубирации с исследуемой сывороткой, позволяют определять в ней уровень аллерген-специфических IgE (sIgE) путем непрямой иммунофлюоресценции.

Технология получения рекомбинантных аллергенов может облегчить стандартизацию аллергенных препаратов, позволяя с высокой точностью обеспечивать содержание главных (мажорных) аллергенов в произведенных сериях лекарственных препаратов. Однако, в любом случае, необходима процедура стандартизации получаемого продукта.

Оценка биологической активности экстрактов аллергенов возможна несколькими методами. Различают in vitro и in vivo диагностику. К методам in vitro относятся: вестерн-блот, изоэлектрофокусирование, IgE-иммуноблот, перекрёстный радиоиммуно-электрофорез, иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), перекрёстный радиоиммуно-электрофорез, ракетный электрофорез по Лореллу, электрофорез в полиакриламидном геле, радиоаллергосорбентный тест (PACT) и др. К in vivo методам относятся кожные пробы: капельные, прик-тесты (тесты уколом), аппликационные (эпикутанный) метод, скарификационные, внутрикожные и др. [72].

Для оценки подлинности препаратов с помощью ИФА используют как положительные специфические сыворотки человека, содержащие IgE или IgG антитела так, и моноклональные антитела к аллергенам. ИФА с использованием моноклональных антител позволяет идентифицировать гомологичные аллергены разных видов, наличие которых важно учитывать при производстве препаратов. Для оценки белкового профиля (разделение белков и определение их молекулярной массы) часто используется метод электрофореза (SDS-PAGE). Для оценки антигенного и аллергенного профилей применяют иммуноблотинг с использованием специфических сывороток.

Биологическую активность аллергенов, как правило, оценивают в тестах ингибиции, например, с использованием ИФА или вестерн-блоттинга. Особенность этих методик заключается в том, что в них предусмотрен этап инкубации разных концентраций исследуемого аллергена со специфичной к нему сывороткой, содержащей высокую концентрацию IgE антител. Истощённая сыворотка затем исследуется с сорбированным аллергеном. При учёте реакции интенсивность окрашивания будет обратно пропорциональна концентрации аллергена, инкубированного с сывороткой. Биологическая (аллергенная) активность исследуемого препарата выражается в условных единицах, вычисляемых относительно стандарта аллергена.

Все применяемые методики диагностики и лечения при аллергии требуют наличия стандартов аллергенов. Стандарты аллергенов должны характеризоваться по содержанию белка, белковому, антигенному и аллергеном профилям. Уровень биологической активности стандартов устанавливается в тестах in vivo с помощью кожных проб или назальных тестов. Спектр методик для оценки показателей качества препаратов аллергенов постоянно расширяется. Следует отметить, что специфическая активность и концентрация аллергенов каждым производителем определяется посредством собственных методологических подходов, т.е. с  использованием своих внутренних стандартов — In House Reference Standard (IHRS) (рис. 6) [73]. Поэтому на рынке существует много препаратов, имеющих различную маркировку коммерческих серий лечебных и диагностических аллергенных экстрактов, характеризующих их иммунологическую активность.

Схема стандартизации с использованием IHRS при производстве препарата
Рисунок 6. Схема стандартизации с использованием IHRS при производстве препарата [12].

Применяемые сегодня методы диагностика аллергии имеют ряд ограничений для осуществления доступного и недорогого исследования пациентов. Так, кожные реакции на аллерген (прик-тест) часто вызывают дискомфорт, имеют риск возникновения анафилактического шока [74] и могут повысить чувствительность пациента к аллергенам [75]. Абсолютно безопасными и более количественными альтернативами для определения sIgE являются лабораторные методы ИФА и ряд их производных [76], однако высокая себестоимость анализа часто ограничивает возможность их широкого использования.

<<< Назад Читать дальше >>>

на главную
Диагностика поллиноза

Ингаляционная аллергия: статьи

Разработка и обслуживание сайта SEOmax

   Яндекс.Метрика